RNAi: A NOVA FACE DA TERAPIA GÊNICA

Basicamente, pequenas moléculas de RNA são sintetizadas nas células, a partir do seu genoma, de modo a produzir estruturas similares a grampos, formando moléculas de RNA dupla-fita que controlam a expressão de genes celulares, seja a partir da degradação do RNA mensageiro, seja a partir de um bloqueio da síntese proteica. Esse sistema interfere na expressão gênica das células, e por isso recebeu o nome de RNA interferência (RNAi). A descoberta do mecanismo de RNAi mudou completamente a forma como entendemos o metabolismo de controle genético na célula humana, e também propiciou uma ferramenta poderosa para inibir genes específicos e assim de terminar sua função na célula. Isso pode ser obtido pela introdução de uma pequena molécula duplex de RNA (19 a 30 pares de base) diretamente nas células em cultura, visando a o silenciamento específico do gene-alvo a ser estudado. Essas moléculas, conhecidas como si RNA (small interfering RNA), devem ser complementares à sequência do gene-alvo e podem reduzir a expressão deste em até 80%. Alternativamente, vetores (em geral derivados de vírus, como adenovírus , retrovírus ou vírus adenoassociados) podem também ser usados par a entregar, no interior das células, genes que expressam uma molécula de RNA palindrômica, que pode gerar uma duplex de RNA na forma de grampo , conhecida como shRNA (do inglês short hairp in RNA). Como o siRNA, o shRNA tem como objetivo o silenciamento do gene-alvo em estudo, apresentando a possibilidade de um silenciamento permanente nas células, no caso de uso d e retrovírus. O mecanismo d e silenciamento gênico por RNAi é ilustrado n a Figura abaixo.

Gráficos da Terapia Gênica

VETORES GENÉTICOS E OS PROCESSOS DE TERAPIA GÊNICA

A tendência é de um aperfeiçoamento cada vez maior da eficiência da terapia gênica. De uma forma genérica, as etapas envolvidas em um experimento de terapia gênica são: o isolamento do gene, a construção de um vetor, a transferência para células no tecido-alvo, e a produção da proteína codificada e expressa pelo gene terapêutico nessas células. A transferência do gene para células está mostrada na figura ao lado.

Para introdução de genes em organismos através de terapia gênica, duas estratégias básicas podem ser utilizadas: in vivo e ex vivo. Na estratégia in vivo, vetores eficientes (como os adenovírus) podem levar o transgene diretamente ao órgão-alvo adequado (como o fígado) por aplicação direta no organismo (como a injeção endovenosa), levando à eficiente expressão do transgene. A estratégia ex vivo baseia-se na modificação de células (como pela infecção por um vetor retroviral) de um tecido-alvo (como os linfócitos), retiradas de um paciente e cultivadas in vitro. Essas células selecionadas, em geral através de uma marca de resistência a antibióticos, que são expandidas e reintroduzidas no paciente, irão expressar o gene exógeno desejado. A possibilidade de realizar protocolos ex vivo tem assumido perspectivas novas na associação de protocolos de terapia gênica e uso de terapia celular, através da modificação genética de células-tronco, que apresentam diferenciação em vários tecidos potenciais.

Principais vírus que servem de vetores para protocolos de terapia gênica

Em 1977, os pesquisadores Michael Wigler e Richard Axel conseguiram a primeira correção genética propriamente dita em células de mamífero cultivadas in vitro. Esses pesquisadores inseriram o gene que codifica a enzima timidina quinase em células portadoras de deficiência nesse gene. A metodologia utilizada, com DNA purificado, apesar de fornecer dados inequívocos, ainda era pouco eficiente. Ganhou força, então, a proposta aventada anteriormente de utilizar vírus não-patogênicos como vetores transportadores de genes. Essa idéia gerou intensas pesquisas e já nos anos de 1983 e 1984 foram propostos os primeiros sistemas de vetores derivados de três espécies virais: retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados (AAV). Uma ilustração desses vírus é mostrada na figura abaixo.

A ideia de usar os próprios vírus como veículos para transportar e introduzir genes em um paciente, promovendo a cura de doenças, é de uma simplicidade extraordinária e abre enormes perspectivas para a saúde humana. Basicamente, essa proposta pretende utilizar estratégias dos vírus, que puderam aperfeiçoar essa “entrega genética” através de evolução por milhões de anos. A consequência do domínio da manipulação dos genes trouxe possibilidades que extrapolam a experimentação em bancada, podendo então ser propostas aplicações clínicas em seres humanos, como as implícitas na definição de terapia gênica, qual seja: “a transferência de material genético novo para células de um indivíduo resultando em benefício terapêutico”. No início do século XXI, com o sequenciamento do genoma humano e o desenvolvimento das ferramentas de comparação de genes baseada na informática, foi desvendado um universo jamais imaginado anteriormente.

Essas ferramentas foram um apoio fundamental na medida em que várias doenças humanas eram, à custa de muito trabalho, relacionadas a defeitos em genes específicos. Os dados do genoma humano foram anunciados várias vezes com pompa e euforia. As manchetes identificavam que, com a “revelação do Livro da Vida”, estaríamos próximos de resolver problemas seculares. De fato, com esses dados foi possível identificar pelo menos 70.000 defeitos genéticos em seres humanos (http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/). A capacidade de interferir na constituição genética de um indivíduo, por meio da terapia gênica, surge então como uma espécie de tábua de salvação para resolver problemas relacionados à saúde humana, pela cura de doenças genéticas herdadas dos pais, ou mesmo de doenças que podem ser adquiridas durante a vida, como o câncer, doenças do coração e infecções virais.

VÍRUS HIV É BLOQUEADO COM TERAPIA GENÉTICA

Uma nova terapia genética, cujos primeiros ensaios clínicos em humanos aconteceram na Inglaterra em Fevereiro ao abrigo do projecto europeu Evi-genoret, poderá prevenir em crianças e jovens a cegueira provocada por mutações no gene RPE65.

Durante um encontro promovido pela Comissão Europeia, em Paris, para divulgar os principais resultados na área da investigação de deficiências visuais e auditivas, o professor Robin Ali do Instituto de Ofratlmologia de Londres explicou que a experiência pioneira consiste na injecção do gene nos pacientes que não o têm.

Os doentes que sofrem desta alteração genética, de transmissão hereditária recessiva (os pais transmitem o defeito, mas não estão doentes), têm apenas visão central, e não a periférica e a noturna. A falta de intervenção clínica nestes casos levará à cegueira depois dos 20 anos.

Os resultados dos primeiros dois ensaios clínicos deverão ser divulgados publicamente dentro de 12 a 18 meses, mas o especialista em genética informou que até ao momento não se registaram quaisquer efeitos secundários.

A intervenção experimental aconteceu após 13 anos de investigação, mas Ali estimou à agência Lusa que os futuros avanços deverão acontecer cada vez mais rapidamente, uma vez que as bases estão construídas.

Dentro de cinco anos, o professor acredita que a tecnologia genética será um tratamento terapêutico efectivo e rotineiro que se estenderá às doenças mais comuns provocadas, por exemplo, pela idade ou diabetes.

A cegueira provocada por problemas no gene RPE65 afecta uma pessoa em cada 100 mil.

O trabalho desenvolvido por Robin Ali insere-se no projecto Evi-genoret, que integra equipes de 12 países, entre os quais Portugal, através da Associação Biomédica e Inovação em Luz e Imagem.

Os principais objectivos do programa, que envolve um investimento de 13,6 milhões de euros (dos quais 10 são suportados pela Comissão Europeia) por quatro anos, são uniformizar e analisar informações desenvolvidas por 25 parceiros acadêmicos e industriais.

Validar essa informação, criando modelos, e desenvolver novas terapias biológicas e genéticas são outras das metas do projeto.

A nível global, estima-se que 50 milhões de pessoas sejam cegas e que nos próximos 20 anos esse valor chegue aos 75 milhões.

Na Europa, 15,5 milhões de indivíduos são deficientes visuais e 2,7 milhões são completamente cegos. O custo financeiro destes problemas está estimado em 100 milhões de euros por ano.

Terapia gênica cura 2 casos de um tipo de leucemia

Cientistas conseguiram, pela primeira vez, curar um tipo de leucemia com terapia gênica. Eles modificaram células do próprio sangue dos pacientes para torná-las capazes de identificar e destruir células cancerosas. Até agora, três pessoas que participaram dos testes clínicos foram beneficiadas: duas não apresentaram nenhum sintoma da doença depois de um ano de tratamento. O terceiro voluntário obteve uma melhora parcial, com diminuição do tumor. 

Todos tinham uma forma grave e avançada de leucemia linfoide crônica (LLC). A única esperança de cura seria o transplante de células-tronco ou de medula óssea, duas técnicas que oferecem um grande risco à saúde. Além disso, nem sempre é fácil encontrar um doador compatível. Os cientistas já estão preparando testes para utilizar a mesma terapia gênica em outros tipos de câncer. 

"Funcionou muito bem. Estamos surpresos com um resultado tão animador", afirma Carl June, pesquisador da Universidade da Pensilvânia, nos Estados Unidos, e coautor do trabalho publicado na última edição das revistas Science Translational Medicine e The New England Journal of Medicine. 

June pondera que a pesquisa terminou há um ano. Agora, é preciso verificar se os resultados são duradouros e o câncer não retornará. 

Os cientistas procuram há anos mecanismos para melhorar a habilidade natural do sistema imunológico de lutar contra tumores. Tentativas anteriores de recrutar células T - os soldados do sistema de defesa no sangue - e alterá-los geneticamente para aumentar sua eficácia não deram certo: as células modificadas não se reproduziam bem e rapidamente desapareciam. 

A equipe utilizou uma nova técnica para inserir novos genes nas células T e sinalizar que elas deveriam se multiplicar e destruir o câncer. 

Os exércitos de células T modificadas destruíram o tecido tumoral. Depois, permaneceram em alerta para matar o câncer caso reaparecesse. 

No estudo, os cientistas coletaram sangue dos próprios pacientes para obter milhões de células T. Elas foram alteradas e reinjetadas nos voluntários.

Os pesquisadores descreveram o relato clínico de um dos pacientes, um homem de 64 anos. Nas duas semanas seguintes à infusão das células modificadas, ele não notou nenhuma diferença. Depois, teve calafrios, náusea e febre: um sintoma de que muitas células cancerosas morriam ao mesmo tempo. "Foi como a pior gripe que ele já pegou na vida", afirma June. "Mas, depois, estava acabado: a leucemia havia desaparecido." As informações são da Associated Press.

Terapia Gênica – Uma Medicina Nova

Durante muitos anos o diagnóstico genético foi baseado apenas em critérios clínicos e em teste bioquímicos de produtos genéticos ou da ausência de determinados genes. Os critérios clínicos são ambíguos e muita das vezes demora anos para desenvolverem, gerando longos períodos de incerteza. Os teste bioquímicos são geralmente estudos caros, que requerem procedimentos invasivos, podendo ter resultados equívocos. Os métodos moleculares utilizados atualmente evitam esse grau de incerteza. Os avanços adquiridos na área de métodos diagnósticos genéticos impulsionaram também avanços na área de terapia gênica.

A terapia gênica é uma estratégia terapêutica que utiliza a técnica de transferência de material genético para modificar o genoma da célula-alvo "in vivo", permitindo a expressão do gene transferido. Os conhecimentos adquiridos com a terapia gênica estimularam estudos em diferentes áreas da medicina. Em cardiologia há inúmeras aplicações da terapia gênica, mas essa fascinante terapêutica tem dificuldades e limitações.

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) inicialmente não seria uma patologia ideal para aplicação da terapia gênica por ser multifatorial e poligênica. Hoje há duas estratégias de manipulação gênica que podem utilizadas na reversão da HAS (1) a inserção de genes que levam a expressão de substâncias vasodilatadoras ou (2) a inibição de genes codificadores de substâncias vasoconstritoras (Hypertension 1999;33:8-13). O melhor entendimento da fisiopatologia da HAS juntamente com os avanços dos desafios da terapia gênica poderá, no futuro, tornar a HAS uma doença curável.

A aplicação da terapia gênica na doença arterial coronária (DAC) abrange o controle da hipercolesterolemia e da trombose, principalmente. Os primeiros protocolos, de terapia gênica, aplicados a hipercolesterolemia foram focados a doença familiar e mostraram uma redução de 17% na concentração sérica de LDL-colesterol após 18 meses de acompanhamento (Nat Med 1995;1:1148-54). Uma das estratégias da terapia gênica para prevenção de trombose consiste em revestir internamente o dispositivo vascular (stent) com uma camada de células endoteliais geneticamente modificadas transfectadas com o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) humano (Circulation,1989;80:1347-53). Ainda é preciso confirmar se a produção local de tPA reduz o risco de trombose.

A angiogênese terapêutica é a administração exógena de fatores de crescimento vascular com objetivo de aumentar ou promover o desenvolvimento de vasos colaterais em tecidos isquêmicos. Losordo et al, em 1998, publicaram os primeiros resultados clínicos com o uso do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) para o tratamento de pacientes com coronariopatia obstrutiva severa (Circulation 1998;98:2800-04). Todos os pacientes obtiveram melhora clínica e laboratorial do quadro de isquemia miocárdica. Agora para que a terapia possa ser aplicada na prática clínica diária é necessário contornar as inúmeras limitações do método.

Recentemente, Strauer et al no Congresso Europeu de Cardiologia (24 de agosto de 2001) mostraram os resultados preliminares do transplante de células em seis pacientes pós-infarto do miocárdio. Após 10 semanas de acompanhamento foi observada redução de um terço da área do infarto, com a terapêutica.

No Instituto do Coração (InCor-HC/FMUSP) o Prof. Dr. José Eduardo Krieger coordena o Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular que desnvolve estudos principalmente na área da hipertensão arterial. Segundo o professor fantástico mundo da terapia gênica é fascinante, mas ainda limitado. São inúmeras as suas limitações e muitas pesquisas precisam ser feitas para que a terapia gênica possa se tornar uma realidade terapêutica.